1 - Esterelização, preparo de meios de cultura e fatores associados ao cultivo de fitopatógenos
1. Introdução – 27
2. Esterilização – 27
2.1. Método físico – 28
2.1.1. Calor – 28
2.1.2. Filtragem – 32
2.1.3. Radiação ultravioleta (UV) – 33
2.1.4. Radiações gama e beta – 33
2.2. Método químico – 34
2.2.1. Gases tóxicos – 34
2.2.2. Soluções desinfestantes – 35
3. Higienização do Laboratório – 36
4. Meios de Cultura – 37
4.1. Classificação dos meios de cultura – 38
4.2. Composição e preparo dos principais meios de cultura – 38
4.2.1. Meios sólidos – 38
4.2.2. Meios líquidos – 46
4.2.3. Meios seletivos para o isolamento de fungos fitopatogênicos e oomicetos – 46
5. Fatores Associados ao Cultivo de Patógenos – 51
5.1. Temperatura – 51
5.2. Luz – 52
5.3. pH – 52
5.4. Aeração – 53
6. Exercícios – 53
7. Referências – 53

2 - Isolamento de Fungos Fitopaogênicos
1. Introdução – 55
2. Métodos Básicos de Isolamento – 56
2.1. Isolamento direto – 56
2.2. Isolamento indireto – 58
2.2.1. Isolamento de fungos dos tecidos de órgãos lenhosos ou carnosos (tronco, raízes, galhos grossos e frutos) – 58
2.2.2. Isolamento de fungos dos tecidos de órgãos não lenhosos ou não carnosos (folhas, ramos finos, radicelas) – 62
3. Métodos Especiais de Isolamento – 64
3.1. Isolamento de fungos de crescimento lento – 64
3.1.1. Isolamento a partir de cirros – 64
3.1.2. Isolamento a partir de ascósporos e basidiósporos ejetados – 65
3.1.3. Isolamento em meio seletivo a partir de tecidos infectados – 67
3.1.4. Sanduíche de cenoura para isolamento de Ceratocystis fimbriata – 68
3.2. Isolamento de fungos de sementes – 70
3.2.1. Fungos externos e internos às sementes – 71
3.2.2. Fungos internos às sementes – 71
3.3. Isolamento de fungos fitopatogênicos do solo – 72
3.3.1. Método de isca qualitativo para Calonectria spp. – 73
3.3.2. Método de isca qualitativo para Rhizoctonia spp. – 75
3.3.3. Método de isca qualiquantitativo para Calonectria spp. e Rhizoctonia spp. – 76
3.3.4. Peneiramento e transferência de solo ou substrato para isolamento de Calonectria spp. e Cylindrocladiella spp. – 79
3.3.5. Oomicetos [Phytophthora spp. e Pythium spp.) – 81
3.4. Isolamento de Ceratocystis fimbriata do solo – 88
4. Exercícios – 89
5. Referências – 91

3 - Armazenamento de microrganismos em cultura com Ênfase em fungos Fitopatogênicos
1. Repicagens Periódicas – 94
2. Armazenamento em Água (Método de Castellani) – 94
3. Óleo Mineral – 96
4. Armazenamento em Grãos de Cereais – 97
5. Armazenamento em Sílica-Gel – 97
6. Armazenamento em Solo – 98
7. Armazenamento em Nitrogênio Líquido – 99
8. Armazenamento por Congelamento – 100
8.1. Em glicerol – 101
8.2. Armazenamento de bactérias por impregnação – 101
8.3. Em tiras de papel-filtro para fungos – 101
9. Armazenamento por Liofilização – 103
10. Exercícios – 105
11. Referências – 105

4 - Produção, determinação e calibração da concentração de inóculo em suspensão
1. Introdução – 107
2. Produção de Inóculo – 108
2.1. Produção de esporos – 109
2.1.1. Produção de esporos em meio de cultura – 109
2.1.2. Produção de esporos na planta hospedeira – 111
2.2. Produção de micélio – 112
3. Determinação e Calibração da Concentração de Inóculo – 113
3.1. Determinação e calibração da concentração de inóculo em suspensões de esporos – 113
3.1.1. Hemacitômetro – 113
3.1.2. Contador automático de esporos – 117
3.2. Determinação da concentração e calibração de inóculo para esporos a seco e para micélio triturado – 119
4. Viabilidade do Inóculo – 119
5. Exercícios – 120
6. Referências – 121

5 - Inoculação de Fungos Fitopatogênicos
1. Introdução – 123
2. Objetivos da Inoculação Artificial – 126
3. Fatores que Afetam a Inoculação – 127
4. Métodos de Inoculação – 130
4.1. Esporos a seco como inóculo – 130
4.2. Suspensão de esporos ou de micélio triturado como inóculo – 131
4.2.1. Fungos não cultiváveis em meios de cultura – 131
4.2.2. Fungos cultiváveis em meios de cultura – 132
4.3. Suspensão de inóculo injetada no caule – 133
4.4. Inoculação com cilindros ou cubos de cultivos artificiais contendo micélio do patógeno – 134
4.5. Infestação de solo e inoculação de raízes – 134
5. Exercícios – 136
6. Referências – 143

6 - Detecção, Isolamento e Inoculação de Bactérias Fitopatogênicas
1. Introdução – 145
2. Detecção de Bactérias Fitopatogênicas – 146
2.1. Detecção de bactérias fitopatogênicas em caules – 146
2.2. Detecção de bactérias fitopatogênicas em folhas – 149
2.3. Outros métodos de detecção de bactérias em plantas – 149
3. Meios de Cultura para Isolamento de Bactérias Fitopatogênicas – 151
4. Métodos de Isolamento – 153
4.1. Isolamento direto – 153
4.2. Isolamento indireto – 156
5. Semeadura da Suspensão de Células em Meio de Cultura Sólido – 157
5.1. Semeadura pelo método de estrias ou riscas – 157
5.2. Semeadura pelo método de diluição em placas – 159
5.3. Semeadura pelo uso de alça de Drigalsky – 160
6. Inoculação de Bactérias Fitopatogênicas – 160
6.1. Preparo do inóculo de bactérias fitopatogênicas – 161
6.2. Quantificação e calibração da concentração de inóculo – 161
6.3. Acondicionamento das plantas antes e depois da inoculação – 162
6.4. Métodos de inoculação – 162
6.4.1. Atomização – 163
6.4.2. Injeção – 163
6.4.3. Imersão de raízes – 164
6.4.4. Outros métodos de inoculação – 165
6.5. Reação de hipersensibilidade (HR) para comprovação de patogenicidade – 167
7. Exercícios – 169
8. Referências – 169

7 - Quantificação de doenças em planta
1. Introdução – 171
2. Definições – 172
3. Métodos de Quantificação da Intensidade de Doenças de Plantas – 174
3.1. Quantificação direta – 174
3.1.1. Medição das dimensões, da área, do volume e, ou, do número de lesões – 174
3.1.2. Quantificação direta da severidade propriamente dita – 176
3.2. Escalas descritivas – 176
3.2.1. Nominais – 176
3.2.2. Graus de ”infecção” – 176
3.3. Escalas de notas – 177
3.3.1. Aritméticas – 180
3.3.2. Logarítmicas – 180
3.4. Escalas diagramáticas (chaves de campo) – 181
3.5. Outros métodos – 184
4. Exercícios – 184
5. Referências – 184

8 - Princípios Básicos da Fotografia Técnica, Fotomicrografia e Micrometria óptica
1. Introdução – 187
2. Câmeras Fotográficas – 188
3. Objetivas – 190
3.1. Objetiva normal – 190
3.2. Teleobjetiva – 191
3.3. Grande angular – 191
3.4. Macro-objetiva – 191
3.5. Objetiva zoom – 192
4. Câmeras Embarcadas para Fotos Aéreas em VANTs – 192
5. Composição Fotográfica – 193
6. Informações Úteis – 195
6.1. Eliminação de sombras – 195
6.2. Horário de fotografar – 195
7. Fotomicrografia – 196
7.1. Composição dos microscópios – 196
7.2. Obtenção de fotomicrografias – 197
8. Micrometria – 198
9. Edição de Imagens – 203
10. Exercícios – 204
11. Referências – 205

9 - Preparações e observações microscópicas de espécimes Fúngicos
1. Introdução – 207
2. Controle da Iluminação – 208
3. Limpeza das Lentes Microscópicas – 209
4. Preparações Microscópicas – 209
4.1. Preparo de lâminas microscópicas temporárias – 211
4.1.1. Lâminas preparadas com fita adesiva – 211
4.1.2. Lâminas de raspagem – 211
4.1.3. Lâminas de cortes histológicos – 213
4.1.4. Microcultura – 216
4.2. Corantes e técnicas de coloração de núcleos – 217
4.3. Coloração com safranina O – 219
4.4. Coloração pelo método Giemsa – 220
5. Exercícios – 222
6. Referências – 222

10 - Microscopia e suas aplicações no estudo das interações Fungo - Planta
1. Introdução – 225
2. Técnicas Microscópicas – 227
2.1. Microscopia óptica – 227
2.2. Microscopia de fluorescência – 229
2.2.1. Técnicas imunocitoquímicas – 229
2.2.2. Corantes fluorescentes – 230
2.2.3. Proteínas fluorescentes verde, azul e vermelha – 230
2.3. Microscopia de varredura a laser confocal (MVLC) – 231
2.4. Microscopia eletrônica de transmissão - Imunolocalização – 232
2.5. Microscopia crioeletrônica – 233
2.6. Microscopia eletrônica de varredura (MEV) – 233
2.7. Microscopia eletrônica associada à microanálise por raios X – 233
3. Métodos – 234
3.1. Clareamento e coloração de estruturas fúngicas em folhas – 234
3.1.1. Técnica de clareamento e coloração de fragmentos vegetais de Bruzzese e Hasan (1983) – 235
3.1.2. Técnica de coloração de cortes por ácido periódico-Schiff (Dring, 1955) – 236
3.1.3. Reagente de Bell (Bell, 1951) – 237
3.1.4. Tionina e Orange G (Stoughton, 1930) – 238
3.1.5. Azul-de-toluidina (Ghemawat, 1977) – 238
3.1.6. Clareamento e coloração de estruturas fúngicas em raízes – 239
3.1.7. Clareamento e coloração de estruturas fúngicas em tecidos lenhosos – 241
3.1.8. Coloração de estruturas fúngicas em material embebido em resina (LR White resin ou Spurr’s resin) – 242
3.2. Histoquímica de compostos fenólicos em tecido vegetal – 243
3.2.1. Compostos fenólicos gerais – 243
3.2.1.1. Cloreto de ferro III (Johansen, 1940) – 243
3.2.1.2. Formalina 4% e sulfato ferroso 10% (Johansen, 1940) – 243
3.2.1.3. Dicromato de potássio (Gabe, 1968) – 244
3.2.1.4. Diazorreação (Ganter e Jollés, 1970) – 245
3.2.1.5. Ação de fluorocromos (Charrière-Ladreix, 1976) “em luz ultravioleta” – 245
3.2.2. Taninos - Vanilina clorídrica (Mace e Howell, 1974) – 246
3.2.3. Lignina – 247
3.2.3.1. Floroglucinol (Johansen, 1940) – 247
3.3. Histoquímica de calose em tecido vegetal – 247
3.3.1. Azul-de-anilina (Smith e Mccully, 1978) “em luz azul” – 247
3.3.2. Calcofluor White “em luz ultravioleta” – 248
3.4. Estudo da interação fungo-planta pela introdução de gene repórter – 248
3.4.1. Proteína verde fluorescente para estudos do crescimento e monitoramento de hifas fúngicas – 249
3.4.2. Proteína verde fluorescente para análise da expressão de genes envolvidos na interação fungo-planta e localização de proteínas de interesse – 250
4. Exercícios – 252
5. Referências – 252

11 - Métodos em nematologia Vegetal
1. Introdução – 257
2. Amostragem – 258
3. Extração de Nematoides – 261
3.1. Extração de nematoides vermiformes do solo – 262
3.2. Extração de cistos de Heterodera glycines a partir de solo seco (Shepherd, 1970) – 267
3.3. Extração de cistos de Heterodera glycines a partir de solo úmido: método da sacarose densa (Dunn, 1969) – 268
3.4. Extração de nematoides das raízes – 268
3.5. Extração de nematoides de partes aéreas de plantas – 270
4. Preparo de Lâminas – 270
4.1. Preparo de lâminas temporárias (Cobb, 1918) – 270
4.2. Preparo de lâminas permanentes – 271
5. Coloração de Nematoides – 274
5.1. Método de coloração de nematoides no interior do sistema radicular de plantas com fucsina ácida (Byrd et al., 1983) – 274
5.2. Método de coloração de massas de ovos de Meloidogyne spp. com fucsina ácida (Silva et al., 1988) – 276
5.3. Método de coloração de massas de ovos de Meloidogyne spp. com floxina B (Taylor e Sasser, 1978) – 277
5.4. Método de coloração de massas de ovos e ovos de Meloidogyne spp. com corantes da indústria alimentícia (Rocha et al., 2005) – 277
6. Inoculação de Nematoides – 278
6.1. Obtenção de ovos e de juvenis de segundo estádio de Meloidogyne spp. para infestação de solo – 278
6.2. Obtenção de ovos e de juvenis de segundo estádio de Heterodera glycines para infestação de solo – 279
6.3. Calibração de suspensões de ovos de Meloidogyne spp. e de Heterodera glycines, para inoculação – 279
7. Identificação de Espécies e Raças de Meloidogyne spp. – 280
7.1. Identificação de espécies por padrão perineal da fêmea – 280
7.2. Identificação de espécies de Meloidogyne spp. pela eletroforese de isoenzimas – 281
7.3. Identificação de espécies e raças de Meloidogyne spp. por hospedeiros diferenciadores – 291
8. Determinação do índice de Galhas – 292
9. Identificação de Raças de Heterodera glycines – 293
10. Referências – 295

12 - Métodos em Virologia Vegetal
1. Introdução – 297
2. Métodos de Diagnose de Viroses Vegetais – 299
2.1. Determinação da gama de hospedeiros de um vírus – 299
2.2. Teste de imunoadsorção com enzima ligada ao anticorpo (ELISA) – 303
2.3. Reação em cadeia da polimerase (PCR) – 306
2.4. PCR em tempo real – 310
3. Métodos Utilizados para Estudo das Propriedades e dos Componentes da Partícula Viral – 315
3.1. Purificação de vírus de plantas – 315
3.1.1. Purificação de um tobamovírus (TMV) – 319
3.1.2. Purificação de um comovírus (BRMV) – 321
3.2. Eletroforese da proteína capsidial de um vírus – 323
3.3. Purificação e eletroforese do RNA de um vírus – 327
4. Métodos para a Caracterização Molecular de Vírus de Plantas – 330
4.1. Amplificação de fragmentos do genoma viral via RT-PCR – 330
4.2. Extração e amplificação do genoma completo de begomovírus – 334
4.3. Clonagem de fragmento do genoma viral amplificado por RT-PCR – 338
4.3.1. Ligação ao plasmídeo vetor – 338
4.3.2. Transformação de Escherichia coli – 340
4.3.3. Extração de DNA plasmidial por lise alcalina – 342
4.3.4. Análise dos plasmídeos recombinantes – 344
4.4. Sequenciamento de DNA – 345
4.5. Análise de sequências – 347
4.6. Caracterização de proteínas virais supressoras de silenciamento – 349
5. Exercícios – 351
6. Referências – 353

13 - Métodos diagnósticos da Podridão do Lenho de Árvores Vivas
1. Introdução – 355
2. Avaliação da Podridão do Lenho por Métodos Não Destrutivos – 356
2.1. Métodos não invasivos – 357
2.1.1. Análise visual – 357
2.1.2. Tomografia de impulso – 367
2.1.3. Tomografia de impedância elétrica – 370
2.1.4. Extensômetro – 371
2.2. Métodos invasivos – 372
2.2.1. Trado de incremento – 372
2.2.2. Furadeira – 374
2.2.3. Resistógrafo – 374
2.2.4. Raios X – 378
3. Exercícios – 384
4. Referências – 388

14 - Princípios e Métodos para Identificação Molecular de Fungos
1. Introdução – 389
2. Obtenção de Culturas Monospóricas – 390
2.1. Isolamento monospórico – 391
2.2. Isolamento monospórico de fungos que produzem esporos no interior de corpos de frutificação – 392
2.3. Fungos com micélio estéril – 394
3. Extração de DNA – 395
3.1. Extração de DNA por resina – 395
4. PCR – 397
4.1. Variações da PCR – 398
4.1.1. PCR convencional – 398
4.1.2. PCR multiplex – 398
4.1.3. Nested PCR – 399
4.2. Reagentes utilizados na PCR – 399
4.2.1. Taq DNA polimerase – 399
4.2.2. Primers – 400
4.2.3. Desoxirribonucleotídeos fosfatados – 401
4.2.4. MgCl2 – 401
4.2.5. Tampão – 401
4.2.6. Água – 402
4.3. Princípios da PCR – 402
4.3.1. Desnaturação – 402
4.3.2. Anelamento – 402
4.3.3. Extensão – 404
5. Eletroforese – 404
6. Identificação Molecular de Fungos – 405
6.1. Detecção de fungos fitopatogênicos utilizando a PCR – 405
6.1.1. PCR em tempo real – 406
6.2. Sequenciamento – 407
6.2.1. Técnicas de sequenciamento – 407
6.2.2. Verificação dos eletroferogramas e obtenção das sequências consenso – 409
6.3. Comparações de sequências em banco de dados – 410
6.3.1. Blast (“Basic Local Alignment Search Tool”) – 411
6.4. Código de barras para fungos – 413
6.5. Análise filogenética na identificação de fungos – 414
6.5.1. Alinhamento múltiplo de sequências – 415
6.5.2. Principais métodos de reconstrução filogenética – 416
6.5.3. Testes de confiança de topologias – 419
6.5.4. Árvores filogenéticas – 419
7. Exercícios – 420
8. Referências – 421

15 - Detecção e Identificação de Bactérias Fitopatogênicas
1. Introdução – 423
2. Meios Seletivos – 424
3. Métodos Sorológicos – 426
3.1. Produção de anticorpos policlonais – 428
3.2. Produção de anticorpos monoclonais – 429
3.3. Conjugação de anticorpos – 431
4. Principais Métodos Sorológicos – 432
4.1. Imunodifusão radial – 432
4.2. Aglutinação – 433
4.3. Imunofluorescência (IF) – 435
4.4. ELISA – 436
4.5. Testes de fluxo – 438
4.6. Teste de “Pocket Diagnostic®” – 439
4.7. Citometria de fluxo – 440
4.8. Imunocaptura magnética – 441
5. Métodos Moleculares – 442
5.1. Extração de DNA de bactérias – 443
5.2. PCR convencional – 446
6. Variações da Técnica da PCR – 449
6.1. BIO-PCR – 450
6.2. Nested-PCR ou PCR aninhada – 450
6.3. Co-PCR – 450
6.4. Multiplex PCR – 451
6.5. Rep-PCR – 452
6.6. RFLP-PCR – 454
6.7. PCR em tempo real – 454
7. Identificação Baseada em Sequências de DNA – 457
7.1. Sequenciamento de genes – 457
7.2. Sequenciamento de genomas – 464
8. Exercícios – 466
9. Referências – 467